Effekte struktureller Modifikationen auf die Funktion neuronaler P2X₃ Rezeptoren

P2X₃ Rezeptoren werden mit hoher Selektivität in nozizeptiven DRG-Neuronen exprimiert. Das Projekt hat unter anderem zum Ziel, verschiedene Mechanismen, welche die P2X₃-Rezeptorfunktion und somit die Schmerzperzeption modulieren können, zu identifizieren. Außerdem ist es für die Entwicklung selektiver P2X₃-Rezeptor-Antagonisten, welche als potentielle Analgetika zur Behandlung verschiedener Schmerzzustände fungieren könnten, unumgänglich, Informationen über die Rezeptorstruktur und -funktion zu erhalten. Im geplanten Projekt wollen wir einerseits nach Erkennungsstellen des P2X₃-Rezeptors für ATP oder seinen Strukturanaloga suchen. Aufbauend auf dem Schlüssel/Schloss-Prinzip der Pharmakologie könnte dies zur Synthese neuer P2X₃-Rezeptor-Agonisten führen.

Andererseits soll aufgeklärt werden, welche Bedeutung extrazellulär lokalisierte N-Glykosylierungsstellen am P2X₃-Rezeptor für dessen Funktion haben. Wir vermuten, dass die pH-Sensitivität des Rezeptors durch Austausch einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen verändert wird, was natürlich von besonderer pathophysiologischer Bedeutung für die Schmerzperzeption in entzündetem Gewebe wäre.

Neben dem P2X₃-Rezeptor exprimieren kleine schmerzrelevante DRG Neurone mit dem TRPV1-Rezeptor einen weiteren im Schmerzgeschehen involvierten Rezeptor. In Vorversuchen konnten wir demonstrieren, dass auch P2X₃- und TRPV1-Rezeptoren sich in ihrer Funktion negativ beeinflussen. Dabei reduzierten sich die durch die jeweiligen Agonisten (a,b-meATP, Capsaicin) ausgelösten Ströme und Ca²⁺-Transienten während der Ko-applikation. Der Mechanismus dieser Wechselwirkung wird im Weiteren untersucht. Anzunehmen ist, dass die beiden Rezeptoren über ihre C-terminalen Enden interagieren. Deshalb werden die C-Termini durch das Einfügen von Stop-Kodons gekürzt bzw. durch den Austausch einzelner Aminosäuren modifiziert, um die relevanten strukturellen Merkmale zu bestimmen.

Ansprechpartner:
Dr. P. Rubini, Tel.: 0341/97-24634 oder -24628

Publikationen:

Wirkner K., Hognestad H., Jahnel R., Hucho F., Illes P. (2005) Characterization of rat transient receptor potential vanilloid I receptor lacking the N-glycosylation site N604. NeuroReport 16, 997-1001.
Wirkner K., Stanchev D., Köles L., Klebingat M., Dihazi H., Flemig G., Vial C.,  Evans R.J., Fürst S., Mager P.P., Eschrich K., Illes P. (2005) Regulation of human recombinant P2X₃ receptors by ecto-protein kinase C. J. Neurosci. 25, 7734-7742.
Stanchev D., Flehmig G., Gerevich, Nörenberg W., Dihazi H., Illes P., Wirkner K. (2006) Decrease of current responses at human recombinant P2X₃ receptors after substitution by Asp of Ser/Thr residues in protein kinase C phosphorylation sites of their ecto-domains. Neurosci. Lett. 393,78-83.
Fischer W., Zadori Z., Kullnick Y., Groger-Arndt H., Franke H., Wirkner K., Illes P., Mager P.P. (2007) Conserved lysin and arginin residues in the extracellular loop of P2X₃ receptors are involved in agonist binding. Eur. J. Pharmacol. 576:7-17.
Gerevich Z., Zadori Z.S., Köles L., Kopp L., Milius D., Wirkner K., Gyires K., Illes P. (2007) Dual effect of acid pH on purinergic P2X3 receptors depends on the histidine-206 residue. J. Biol. Chem. 282:33949-33957.

Lokalisation Schmerz-relevanter P2X Rezeptoren in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen entlang der aufsteigenden Schmerzbahnen


P2X₃ Rezeptor-vermittelte Stromantwort


Interaktion zwischen P2X₃­- und TRPV1-Rezeptoren in kleinen schmerzrelevanten DRG-Neuronen

Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten mittels extrazellulärem ATP und Glutamat

Ausführliche Untersuchungen belegen, dass kultivierte Astrozyten über exozytotische Mechanismen sog. Gliotransmitter freisetzen können. Diese synaptischen Ereignisse sind durchaus nicht nur auf kultivierte Astrozyten beschränkt sondern werden auch in astrozytär-neuronalen Netzwerken von Gehirnschnitten beobachtet.

Eigene frühere Experimente an Hirnschnitten der Ratte zeigen, dass ATP aus Astrozyten der Schicht V des präfrontalen Kortex (PFK) Glutamat auf die benachbarten Pyramidenzellen freisetzen kann. Dieses Glutamat könnte metabotrope Glutamatrezeptoren aktivieren, die dann die Leitfähigkeit neuronaler NMDA-Rezeptoren steigern. Nun sollen zusätzliche Experimente zur Klärung der Feinabstimmung neuronal/astrozytärer Netzwerke im PFK durch ATP und Glutamat durchgeführt werden. Im Projekt wird nach der prä- und postsynaptischen modulatorischen Funktion neuronaler P2-Rezeptoren allein und in Interaktion mit ionotropen und metabotropen Glutamatrezeptoren gesucht. Dabei wird das Augenmerk insbesondere auf die durch Nervenreize ausgelösten astrozytären exzitatorischen synaptischen Ströme und ihre Langzeitmodulation durch repetitive Stimulation gerichtet. Sowohl die ATP-sensitiven P2X-, als auch die ATP/UTP-sensitiven P2Y-Rezeptoren stehen dabei im Mittelpunkt der Forschungsarbeit.

Insbesondere interessieren synaptische Plastizitätsvorgänge der beiden miteinander kommunizierenden Zelltypen. Es werden die folgenden Fragestellungen bearbeitet: (A) Über welchen Mechanismus moduliert ATP NMDA-Ströme in astrozytär-neuronalen Netzwerken der PFK-Gehirnschnitte von Ratte und Maus? (B) Kann diese Modulation an enzymatisch dissoziierten und von den Astrozyten isolierten Pyramidenneuronen ebenfalls beobachtet werden? (C) Erzeugt neuronale Reizung an innervierten Astrozyten exzitatorische synaptische Ströme? (D) Vermitteln astrozytäre P2Y- und neuronale mGlu-Rezeptoren synaptische Plastizitätsereignisse an PFK-Pyramidenzellen? (E) Können repetitive neuronale Reize eine Langzeitmodulation der astrozytären EPSCs auslösen? (F) Korreliert die immunhistochemisch nachgewiesene Lokalisation der Rezeptoren mit ihrer elektrophysiologischen Funktion?

Ansprechpartner:
Dr. T. Riedel, Tel.: 0341/97-24613
Prof. Dr. P. Illes, Tel.: 0341/97-24614

Publikationen:

Wirkner K., Köles L., Thümmler S., Luthardt J., Poelchen W., Illes P. (2002) Interaction between P2Y and NMDA receptors in layer V pyramidal neurons of the rat prefrontal cortex. Neuropharmacol. 42, 476-488.
Luthardt J., Borvendeg J.S., Sperlagh B., Poelchen W., Wirkner K., Illes P. (2003) P2Y₁ receptor activation inhibits NMDA receptor-channels in layer V pyramidal neurons of the rat prefrontal and parietal cortex. Neurochem. Int. 42,161-172.
Wirkner K., Günther A._, Weber M., Guzman J.S., Krause T., Fuchs J., Köles L., Illes P. (2007) Modulation of NMDA receptor current in layer V pyramidal neurons of the rat prefrontal cortex by P2Y receptor activation. Cerebral Cortex 17:621-631.

Elektrophysiologische und immunohistochemische Charakterisierung von Pyramidenzellen und Astrozyten der Schicht V des präfrontalen Kortex der Ratte. Zwei-Elektroden whole-cell Patch-Clamp Ableitungen.

Neuronale Plastizität der afferenten synaptischen Übertragung an Schicht V-Pyramidenzellen
des präfrontalen Kortex im Gehirnschnittpräparat

Durch hochfrequente Reizung der Afferenzien in Schicht II des PFK von Ratten kann in Schicht V bei etwa 60% der untersuchten Pyramidenzellen LTD ausgelöst werden. Die restliche Zellpopulation reagierte auf diese Form von Reizung mit keiner Langzeitänderung der Amplituden von exzitatorischen postsynaptischen Strömen (EPSC). Das Verwenden entsprechender Agonisten (ADP-b-S) und Antagonisten (PPADS, MRS2179) zeigte, dass die P2Y₁-Rezeptorstimulation den Anteil der plastischen Zellen vermindern kann. In darauffolgenden Experimenten verwendeten wir ein niederfrequentes Stimulationsprotokoll, das im PFK bei allen untersuchten Pyramidenzellen der Schicht V zur Entwicklung einer LTD geführt hat. Eine ausführliche pharmakologische Analyse soll zeigen, inwieweit diese LTD von der Aktivität spannungsabhängiger Ca²⁺-Kanäle und der Aktivierung mGluR abhängt. Im weiteren wird der Einfluss verschiedener P2-Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten auf die LTD untersucht. Dabei werden auch P2Y-Rezeptor knockout-Mäuse eingesetzt.

Ansprechpartner:
Prof. Dr. P. Illes, Tel.: 0341/97-24614

Publikationen:

Guzman SJ, Gerevich Z, Hengstler JG, Illes P, Kleemann WJ. (2005) P2Y1 receptors inhibit both strength and plasticity of glutamatergic synaptic neurotransmission in the rat prefrontal cortex. Synapse. 57:235-238.

Modulation der synaptischen Tansmission durch P2X- und TRPV1-Rezeptoren im Schnittpräparat des Locus coeruleus der Ratte

Der Nucleus Locus coeruleus (LC) gehört u den größten Kerngebieten im Gehirn von Säugetieren und enthält noradrenerge Neuronen. Die Erregbarkeit von LC Neuronen wird sowohl durch excitatorische als auch inhibitorische Fasern reguliert. Es wurde gezeigt, das Capsaicin, der schafe Inhaltsstoff des Chillies, die Aktivität von LC Neuronen durch präsynaptische Modulation der spontanen Glutamatfreisetzung steigern kann (Marinelli et al., 2002, J. Physiol. 543:531-540). Darüber hinaus führt Capsaicin aber auch zu einer Freisetzung von Noradrenalin bzw. Adrenalin im LC. Eine mögliche Quelle der Adrenozeptor-Agonisten könnten die Terminalen noradrenerger Fasern aus dem Nucleus Tractus solitarius  sein. In der Vergangenheit haben wir gezeigt, dass ATP als Kotransmitter von Noradrenalin im LC fungieren kann und nach Applikation an einzelne LC Neurone P2X-Rezeptor-vermittelte Einwärtsströme induziert. In diesem Projekt soll nun untersucht werden, ob ATP die spontane glutamaterge synaptische Transmission  in LC modulieren kann und ob es Interaktionen mit der Capsaicin-induzierten Modulation der Glutamatfreisetzung gibt.

Ansprechpartner:
Prof Dr. P. Illes, Tel.: 0341/97-24614

Morphologische und funktionelle Eigenschaften von LC-Neuronen der Ratte