Cell Techniques and Applied Stem Cell Biology

Negativ-Ionen MALDI-TOF-MS von mit Chondroitinase ABC verdautem nativen Schweineknorpel (a), isolierten Chondro-itinsulfat (b) und künstlichem Agarose-basiertem Knorpel¬konstrukten nach einer Kultivbierungszeit von 4 Wochen (c).

Entwicklung eines sterilen Bioreaktor-systems zur individuellen Knorpelzüchtung mit NMR quality control / quality assurance (QC/QA)-Analyse

Zur Evaluierung der exprimierten Knorpelmatrix und zur Kontrolle des künstlichen Gewebes sollen Methoden der Kernresonanzspektroskopie (NMR) eingesetzt werden, um eine quality control/quality assurance (QC/QA) - Analyse sicherzustellen. Durch hochauf­gelöste 13C-NMR-Spektroskopie ist es möglich, die Chondroitinsulfatkomponente der Knorpelmatrix zu erfassen, die eine hohe Beweglichkeit besitzt. Für die Untersuchung der Kollagenkomponente des künstlichen Knorpels werden Festkörper-NMR-Methoden verwendet. Zur eindeutigen Detektion der 13C-Signale der Knorpelmatrix werden Zellkulturmedien verwendet, die 13C-markierte Precursormoleküle für die Matrixsynthese enthalten. Physikochemische Eigenschaften des künstlichen Knorpels werden mittels moderner NMR-Verfahren bestimmt und mit denen von nativem Knorpelgewebe verglichen, um so die optimalen Bedingungen für die Herstellung von künstlichem Knorpelgewebe zu finden. Durch quantitative NMR-Messungen wird der Aufbau der extrazellulären Knorpelmatrix (EZM) dokumentiert und der geeignete Zeitpunkt für die Reimplantation des künstlichen Knorpelgewebes in den Patienten bestimmt. Zusätzlich erfolgt eine Analyse des Zellkulturmediums mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie hinsichtlich der gebildeten Matrixkomponenten. Schließlich soll ein Bioreaktor zur Knorpelherstellung entwickelt werden, der vollkommen NMR-kompatibel ist, d.h. der Lösungs- und Festkörper-NMR-Untersuchungen erlaubt, ohne dass der sterile Kreislauf des Zellkulturmediums und die Expression der künstlichen Knorpelmatrix unterbrochen wird.

Die Evaluierung der spektroskopischen Resultate hinsichtlich der Neusynthese von Knorpelmatrix aus Glycosaminoglycanen und kollagenen Bestandteilen in dem Knorpel­transplantat erfolgt über etablierte bioanalytische Standardmethoden der Immunhistochemie, Histologie, Proteinanalyse sowie der Genexpressionsanalytik basierend auf der DNA-Microarraytechnologie. Die Kopplung dieser Methoden lässt eine functional genomics - Analytik der stimulierten Chondrozytenkultur zu und gibt Aufschluss über die Wirksamkeit des Druck- und Perfusionsschemas im neu entwickelten Bioreaktorsystem. Basierend auf der Datenevaluierung der NMR-, Bio- und Genexpressionsanalytik des in vitro gezüchteten Knorpelzellkonstruktes lässt sich der ideale Implantationszeitpunkt des, in einer präklinischen Phase, ankultivierten autologen dreidimensionalen Gewebeersatzes bestimmen.

Das Projektziel ist es, ein neuartiges, automatisiertes GMP-geeignetes Kultivierungs­verfahren in einem innovativen Reaktorsystem bereitzustellen, welches adaptiv mit NMR-Modulen zur Charakterisierung der Knorpelmatrix durch die industriellen Kooperations­partner dem Markt angeboten werden kann. Weiterführende veterinär- und human­medizinische Studien hinsichtlich der Transplantateigenschaften und des regenerativen Potenzials zur Therapierung von traumatischen und degenerativen Gelenkserkrankungen können an der Orthopädischen Klinik in Leipzig am Modellorganismus durchgeführt werden.